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本制品是一种基于SYBR Green染料用于一步法反转录实时荧光定量PCR，即qRT-PCR或real-time RT-PCR的新型高品质防污染预混液试剂盒，主要用于RNA的特异性超高灵敏度定量检测。

本试剂盒包含了BalbRT M-MuLV反转录酶、ByFast Taq DNA聚合酶、UDG酶、PCR Buffer、dNTPs、dUTP、SYBR Green I荧光染料、稳定剂、无核酸酶水、ROX (根据不同荧光定量PCR仪进行选择)和镁离子等所有的通用组分，使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物和样品RNA即可。

本试剂盒整合了高效的BalbRT M-MuLV反转录酶、RNase抑制剂和优异的抗体结合型热启动ByFast Taq DNA聚合酶，并优化了缓冲体系，反转录性能优、检测灵敏度高、扩增特异性强、反应稳定性好，非常适合于內源低丰度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的检测。

本试剂盒使用的ByFast Taq DNA聚合酶是一种与抗体结合的高品质热启动酶，能够实现便捷高效的热启动。Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合，从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活，这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来，预变性之前不会发生DNA聚合反应，从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性。

本试剂盒使用SYBR Green I作为染料。SYBR Green I是一种结合于双链DNA(dsDNA)双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱，一旦与双链DNA结合后，其荧光会大大增强。这样通过检测荧光强弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。

本试剂盒含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP，可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。UDG也称UNG，可催化含尿嘧啶的DNA链中的尿嘧啶(dU)碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键发生水解，从而释放游离尿嘧啶，主要应用于消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题。其防止污染的原理为：在PCR反应中加入适量的dUTP，以dUTP替代dTTP掺入DNA中，形成含dU碱基的PCR扩增产物；后续进行PCR反应时，使用UDG酶选择性切割可能被污染而带入的之前PCR扩增产生的含有dU的单链或双链DNA，从而避免之前的PCR扩增产物可能的污染对于本次PCR扩增带来的负面影响。

• 请注意避免RNase污染，使用RNase-free的枪头、离心管等。
  
• 20×SYBR One-Step Enzyme Mix(UDG)含有高浓度甘油，粘度高，使用前将短暂离心至管底，并用移液器轻轻混匀，混匀过程中尽量避免产生气泡，然后缓慢准确吸取。
  
• 使用前需确保2×SYBR One-Step Reaction Buffer完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。
  
• 如果扩增片段较长或者RNA结构较为复杂，可将模板RNA在65℃预处理5～10分钟，可提高反转录效率。
  
• 本反应使用qPCR的Reverse Primer作为反转录的基因特异性引物，不能使用Random Hexamer Primer或Oligo(dT) Primer等常用于cDNA第一链合成的引物。
  
• 注意引物退火温度，当退火温度<60℃时，推荐使用三步法PCR扩增。
  
• 本制品中含有SYBR Green I荧光染料，保存本制品或设置PCR反应时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。
  
• 对于超过350bp或者高GC含量的扩增片段，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。
  
• 经测试，本制品反复冻融10次对使用效果无显著影响。但仍需尽量避免反复冻融本制品，反复冻融可能使产品性能下降。
  
• qPCR检测是超高灵敏度的检测，尽管本制品有很好的防污染效果，PCR反应设置区域还是需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

• One-Step qRT-PCR反应体系的设置：
  
  • 融解并混匀One-Step qRT-PCR反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。
    
  • 参考下表在室温或冰浴上设置One-Step qRT-PCR反应体系(以96孔板，每孔反应体系为20μL为例)：
    

    成分	用量	终浓度
    2×SYBR One-Step Reaction Buffer	10μL	1×
    20×SYBR One-Step Enzyme Mix(UDG)	1μL	1×
    Forward and Reverse Primer Mix (3μM each)	2μL	300nM
    模板RNA	2μL	1pg～2μg
    Without or Low/High ROX (50X)	0.4μL	1×
    RNase-Free Water	至20μL	-

    • 当检测样品比较多时，可根据样品数量先配制所需的相同试剂的混合液，一般多配制5～10%，然后再分装到每个反应孔中，最后再在每个反应孔中加入不同的试剂，这样可使所取的试剂体积更准确更均一，误差更小，并减少试剂损失。例如：检测的目的RNA相同，而RNA样品不同，则可以把除RNA样品外的所有试剂根据样品数量配制在一起，然后分液至每个反应孔中，最后再加入不同的模板RNA。
      
    • 通常引物的终浓度为0.2～0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1～1.0μM范围内调整引物的终浓度。为了获得理想的qPCR的效果，扩增片段的长度建议为80～200bp。
      
    • 通常RNA模板的量以1pg～2μg为参考用量，一般总RNA为100ng～1μg。因不同物种的模板中含有RNA的拷贝数不同，如有必要，可对模板RNA进行梯度稀释，以确定最佳的模板RNA使用量。同时，由于qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入RNA模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响，因此建议将模板RNA适当稀释后加入反应体系中，比如每个20μL反应体系2～5μL，这样可以有效提高实验的重复性。
      
    • 不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX、低浓度ROX或不加ROX。
      
    • 96孔板的推荐反应体系为20μL，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。
      
    • 建议设置不加模板RNA的阴性对照组。
  • 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
    
  • 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。
• One-Step qRT-PCR反应程序：
  50℃ 10分钟一般可以得到理想的反转录效果，但如果片段较长，也可以适当增加。在Real-time PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为94℃ 2分钟，复杂或高GC模板适当延长时间至5分钟。本制品中的ByFast Taq DNA聚合酶可以在15秒内可完成至少300bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。建议采用如下的PCR程序，本程序是以ABI QuantStudio 6 Flex荧光定量PCR仪为例：
  
  • UDG酶处理：37℃ 5min
    
  • 反转录：50℃ 10min
    
  • 预变性：94℃ 2min
    
  • 变性：94℃ 15sec
    
  • 退火/延伸：60℃ 15～30sec
    
  • 重复步骤d和步骤e，总共35～45个循环
    
  • 熔解曲线分析(可选)：95℃ 15sec,60℃ 15sec,95℃ 15sec
    
  • 使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果
  • 三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，随后重复步骤d、e及增加的这一步骤共35～45个循环即可。
  • 复杂模板反转录温度可升高至55～60℃，以提高反转录效率。
    
  • 以上举例为常规qPCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因仪器、模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。

• 荧光定量PCR结果不理想，出现特异性不好或扩增效率不高时，可能是由于以下原因造成：
  
  • 样品RNA发生降解。此时可以通过RNA电泳等方法确认所使用的RNA样品是否发生明显的降解，在反转录实验前的实验操作过程中需要严格注意无RNA酶的实验操作。
    
  • 引物设计不佳。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。也可以尝试使用有文献报道使用过的引物，或者从百奥莱博订购经过测试的qPCR引物。
    
  • 待扩增片段GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时宜更换引物。
    
  • PCR反应体系在室温设置时容易导致非特异性条带，但在使用热启动酶时可以有效避免室温操作导致的非特异性条带的产生。但对于一些较难扩增的产物，可以尝试在冰浴上设置PCR反应体系，以进一步减少非特异性的DNA扩增。
    
  • 退火温度不佳，需要优化。这种情况下宜更换引物。
    
  • 待扩增片段GC含量较高或长度较长，变性不够充分。此时宜更换引物，使待扩增片段的GC含量和长度适中。
    
  • 模板量太低，此时宜适当加大模板量。
    
  • 模板中含有抑制PCR反应的物质，可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。
• 反应条件优化方法：
  
  • 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM时可获得良好检测效果，终浓度可以在0.1～1.0μM范围内适当调整。如果希望提高反应特异性，可降低引物浓度；如果希望提高扩增效率，可增加引物的浓度，从而优化反应体系。
    
  • 退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。如果希望提高反应特异性，可提高退火温度，以60～64℃作为退火温度的调整范围。在引物Tm值较低而得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56～64℃作为温度设置的参考范围。
    
  • 延伸时间：建议采用两步法PCR，延伸15～30秒。对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。